Práticas de Laboratório: 2009

INTRODUÇÃO:

Para a análise do DNA de celular eucarióticas, a primeira etapa é o seu isolamento. O procedimento a seguir é utilizado para extrair grandes quantidades de DNA a partir de uma cebola. Procedimentos similares são usados nas extrações de DNA de outras fontes, como amostras de sangue, tecidos, etc.
A extração de DNA de células eucariontes consta fundamentalmente de três etapas:
1º Ruptura (física e química) das membranas celulares para a liberação do material genético;
2º Desmembramento dos cromossomos em seus componentes básicos: DNA e proteínas;
3º Separação do DNA dos demais componentes celulares.

Figura 1

Figura 2

Figura3

Figura 4

MATERIAIS:
QUANTIDADE-MATERIAL
01-Espátula
01-Faca
02-Béqueres de 250ml
03-Tubo de ensaio
02-Provetas de 50ml
01-Bastão de vidro

01-Funil de vidro
01-Suporte universal
01-Anel ou argola
01-Papel filtro
01-Banho-maria 60° C

PRODUTOS/REAGENTES
01-Cebola picada
--Água filtrada
--Detergente
--NaCl (sal de cozinha)
--Álcool etílico gelado
--Gelo

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:

· Com o auxílio de duas provetas, transfira 10ml de detergente e 20ml de água em um béquer de 250ml;

· Com o auxílio de uma espátula, coloque uma pitada de sal nesse mesmo béquer e agite com um bastão de vidro;

· Coloque a cebola picada nesse mesmo béquer (com a solução de lise-detergente), mexa bem e leve ao banho-maria por exatamente 15 minutos a 60°C;

· Resfrie a mistura do banho-maria, colocando o béquer no gelo por cerca de 5 minutos, mexendo periodicamente;

· Filtre a mistura, recolhendo o filtrado em um béquer limpo;

· Transfira pequenas quantidades do filtrado em tubos de ensaio limpos e secos;

· Adicione lentamente pela borda do tubo de ensaio o álcool etílico comercial gelado (aproximadamente o dobro do volume do filtrado). ATENÇÃO! ALCOOL É UM PRODUTO INFLAMÁVEL

· Espere alguns minutos. Bolhas irão se formar e as moléculas de DNA vão precipitar;

· Mergulhe o bastão de vidro no tubo de ensaio fazendo movimentos circulares cuidadosos.

ATENÇÃO!! Não mexer muito para as camadas não quebrarem as moléculas de DNA;

· Os “fios” esbranquiçados e grudentos formados são aglomerados de muitas moléculas de DNA e ficarão presos na ponta do bastão de vidro.

ATIVIDADES:

01- Por que a cebola deve ser picada?
Para fragmentar o tecido vegetal que forma o catáfilo da cebola e consequentemente permitir a ruptura da membrana plasmática que forma as células da cebola.

02- Por que é usado detergente? Qual a importância do aquecimento no procedimento experimental?
Para fazer a ruptura da membrana plasmática, pois a água, o sal e o detergente alteram o pH e a concentração do meio externo, plasmolizando a célula. Enquanto o aquecimento dilata o núcleo, expondo o material genético.

03- Qual a função da adição do álcool?
Como o álcool tem uma densidade menor do que a da água (0,785 g/cm cúbico) ele flutua juntamente com as proteínas, enquanto a solução lise-detergente precipita com o DNA, formando uma solução branca e semelhante a fios esbranquiçados.

04- Por que você não pode ver a dupla-hélice do DNA?
Apesar do ácido nucléico ser uma macromolécula, trata-se de uma estrutura ultra-microscópica.

05- Através de desenhos esquematize o procedimento experimental.
Resposta pessoal.